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淺析梯度PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理
  梯度PCR基因擴(kuò)增儀能滿足不同工作環(huán)境的多種需求??捎米饕跃酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析?;驍U(kuò)增儀廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達(dá)等領(lǐng)域。
 
  1、基因擴(kuò)增的基本要素:
 
  基因擴(kuò)增的基本要素與DNA復(fù)制的基本要素是一致的。
 
 ?、貲NA模板:待拷貝的DNA稱為模板,它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA,最后擴(kuò)增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。
 
 ?、谝铮菏荄NA復(fù)制的先鋒,就象結(jié)晶過程中的晶核,引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴(kuò)增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
 
  ③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):是DNA復(fù)制的動力,在dNTP等底物存在時在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補(bǔ)的DNA鏈。
 
 ?、芫彌_液:提供DNA合成反應(yīng)所需的pH,離子強(qiáng)度等環(huán)境。
 
 ?、?種單核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料。
 
  2、梯度PCR基因擴(kuò)增儀原理:
 
  梯度PCR基因擴(kuò)增儀是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成,用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。
 
  PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán),每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高,如果循環(huán)次數(shù)是30次,那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個分子)。PCR反應(yīng)每個循環(huán)的三個基本反應(yīng)步驟如下:
 
  ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
 
  ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;
 
 ?、垡锏难由欤簻囟壬?2℃左右,DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
 

上海睿玥實(shí)驗(yàn)器材有限公司主營產(chǎn)品:全自動熔點(diǎn)測定儀,梯度PCR基因擴(kuò)增儀,平行反應(yīng)合成儀
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