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 PCR-RFLP 反應

PCR反應體系:在 200ul離心管中進行，反應總體積為30ul， 反應體系包括2XPCR預混液15ul,鑒別引物(30umol/L)各0.5ul,模板 l ul，無菌超純水13ul。將離心管置PCR儀，PCR反應參數(shù):95°C 預變性4分鐘，循環(huán)反應30次(95°C 30秒，55?58°C ，72°C 3 0 秒 )，7 2 °C延 伸 5 分 鐘 。 取 P C R 反 應 液 ，置 500ul離心管中，進行酶切反應，反應總體積為20ul，反應體系包括10X酶切緩沖液2ul,PCR反應液6ul，Sma I(10U/M1) 0.5ul，無菌超純水11.5ul,酶切反應在30°C水浴反應2小 時。另取無菌超純水，同法上述PCR-RFLP反應操作，作為空白對照。

電泳檢測照瓊脂糖凝膠電泳法(中國藥典2020年版通則0541)

膠濃度為 1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對照藥材 酶切反應溶液的上樣量分別為8ul, DNA分子量標記上樣量為 l ul (0.5ug/ul)。電泳結束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥材 凝膠電泳圖譜相應的位置上，在100?250bp應有兩條DNA 條帶，空白對照無條帶。